日前，基因編輯先驅劉如謙博士和他在MIT與哈佛大學的團隊在《科學》上發布了一項創新的突破性研究。與以往不同的是，這次該團隊論文的焦點并不是在基因編輯，而是在于一款能夠通過特定分子膠調控的蛋白降解系統的開發。該系統理論上可以在生物體內有選擇性地調控任意內源性蛋白的表達，不僅在科學研究上有著廣泛的應用前景，也為臨床治療方法的開發提供了巨大的潛力。
在精準的時間內以選擇性的方式降解特定蛋白質對細胞的正常運行和功能至關重要。這一過程依賴于蛋白酶體系統對特定的氨基酸序列或構象的識別，這些序列或構象被稱為蛋白降解子（degron）。其中一類降解子能夠通過與分子膠等小分子的結合發生構象變化，從而促進帶有該降解子的蛋白與E3泛素連接酶的結合，導致蛋白的降解。如果能將編碼這種降解子的序列插入到特定內源性蛋白的序列中，就可以通過小分子來調控體內這種蛋白的水平，這不僅是一種有用的研究工具，也有潛力成為一種臨床治療方法。通過小分子來調節內源性蛋白質水平是一項挑戰。首先，大多數已知的可被小分子誘導發生構象變化的降解子，其長度通常超過100個氨基酸。這樣長的序列難以插入細胞DNA，并通過細胞的內源性表達系統進行調控。盡管鋅指蛋白（ZF）中的降解子長度較短，但它們通過沙利度胺（thalidomide）等分子膠小分子誘導的降解并不具有足夠的特異性，許多非目標蛋白也會受到影響，這限制了其應用范圍。沙利度胺及其類似物泊馬度胺（pomalidomide）等為已獲批的免疫調節藥物（IMiD），它們能與CRL4CRBN E3泛素連接酶中的底物受體蛋白cereblon（CRBN）相結合，改變CRBN所靶向底物蛋白的特性，使得CRL4CRBN E3泛素連接酶得以與新的底物蛋白相連并誘導該蛋白后續的降解。因此，一個理想的降解子需要具備幾個特性：尺寸足夠小，便于通過基因編輯技術將之精確敲入內源蛋白序列中；能夠對具有細胞滲透性的小分子產生反應；不引發脫靶效應；并且不受“鉤狀效應（hook effect）”的影響。鉤狀效應指的是在高濃度下，因為蛋白質-小分子復合物相互競爭，導致產生能夠進行有效降解的蛋白復合物難以形成的情形。不過這種現象多見于二價小分子降解劑，較少見于分子膠。為了成功調控內源蛋白水平，該研究團隊在之前便開發了一款名為PT-179的沙利度胺衍生物。PT-179在之前研究中便被證實能夠與CRBN蛋白結合，但卻不引發非靶向蛋白的降解。在這次研究當中，該團隊開發了一種稱為噬菌體輔助分子膠復合物連續進化平臺（MG-PACE），并使用該平臺來進行一系列的序列篩選與蛋白進化過程，最終識別出能與CRBN蛋白、PT-179形成三元復合物的ZF蛋白降解子序列。
▲通過MG-PACE平臺開發識別出由PT-179分子膠所調控的SD40蛋白降解子（圖片來源：參考資料[1]）
這個識別出的ZF蛋白降解子名為SD40，僅包含36個氨基酸，因此可以通過先導編輯（prime editing）準確、有效率地插入人類細胞中的靶向DNA序列。研究人員發現，PT-179會誘導帶有SD40降解子標簽的人類蛋白快速地降解。通過高分辨率冷凍電子顯微鏡（cryo-EM）的結構分析也發現，SD40與CRBN的C端結構域相互作用，這是CRBN蛋白與PT-179結合之處。但同時科學家也發現SD40還與CRBN的N端結構域形成廣泛的界面，這樣的相互作用之前未曾在CRBN蛋白與ZF蛋白之間觀察到過。由于人類和小鼠細胞中降解蛋白質的機制不同，該團隊還利用MG-PACE平臺開發了另一款適用于小鼠細胞的ZF蛋白降解子SD56。除了PT-179，攜帶SD56標記的小鼠細胞內蛋白也能響應包括泊馬度胺和美齊格多胺（mezigdomide）在內的傳統及新一代IMiD，從而實現對小鼠特定內源性蛋白水平的調節。這一機制可應用于研究與人類疾病相關的轉基因小鼠模型，具有重大的研究潛力。
▲SD40、CRBN與IMiD衍生物結合的蛋白復合物的冷凍電鏡結構（圖片來源：參考資料[1]）
“我們已經證明，連續進化平臺是建立分子膠系統的有效方法，這將會是項有用的研究工具。”劉如謙博士說道。
SD40和SD56蛋白降解子的研發使得科研人員能夠在幾分鐘內通過添加PT-179來去除目標蛋白，同時保留了相應基因的DNA背景，極大地減少了對眾多天然蛋白質關鍵調控機制的干擾。研究天然調控下內源蛋白質的丟失是生物學的一個重要目標，除了可以驗證藥物靶標，還得以進一步研究生物體中天然蛋白質功能。“過去的其他系統能夠對細胞中的外來蛋白質進行降解，但使用我們研發出的這種有效降解子則得以對細胞內的天然目標蛋白進行降解，這更具生物學意義。”論文的共同第一作者Jaron Mercer博士說道。研究人員已經與癌癥和其他領域的科學家合作，將利用他們所研發的蛋白降解子來標記具有潛在治療意義的蛋白質。希望這項突破性技術平臺的開發能夠在未來獲得更廣泛的應用，協助廣大研究人員進行更具轉化意義的科學研究，帶來更為有效、創新的療法。
